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當(dāng)前位置：首頁技術(shù)文章奶粉中的維生素A、D3、E的測(cè)定（固相萃取-液相色譜法）

奶粉中的維生素A、D3、E的測(cè)定（固相萃取-液相色譜法）

更新時(shí)間：2015-07-05點(diǎn)擊次數(shù)：7346

目前對(duì)奶粉中脂溶性維生素A、D3、E測(cè)定的前處理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化過程后使用大量的有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取以洗除雜質(zhì)，操作步驟復(fù)雜，維生素D3樣品還需經(jīng)硅膠柱做進(jìn)一步的凈化才能進(jìn)行檢測(cè)，造成實(shí)驗(yàn)時(shí)間成本的增加，不利于大批量樣品的檢測(cè)。本文研究了利用固相萃取法作為奶粉樣品的前處理方法，液相色譜法作為檢測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定奶粉中維生素A、D3、E的含量，該方法可簡(jiǎn)化奶粉樣品的前處理過程，節(jié)省有機(jī)溶劑的使用，操作簡(jiǎn)便。

1. 樣品處理

皂化提取：2g奶粉加入1mL水混勻，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁處理，混勻，加入10mL氫氧化鉀堿液（1.25g/mL），55℃條件下，水浴皂化45min，取出冷卻至室溫，向皂化液中加入適量無水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min離心5min后，取上清液，用1至2個(gè)微孔過濾器對(duì)其進(jìn)行過濾，至Qdaura 卓睿™全自動(dòng)固相萃取儀上樣管中作為待凈化液。

2. 固相萃取凈化

QdauraTM卓睿全自動(dòng)固相萃取儀程序設(shè)定：5mL甲醇，和5mL水活化，加樣，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脫，收集。收集液于40℃氮?dú)獯蹈桑?/SPAN>1mL甲醇定容，0.45um PTFE過濾器過濾，準(zhǔn)備進(jìn)液相色譜分析。

3. 色譜條件

液相色譜儀：LC-10F

色譜柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；

流動(dòng)相：甲醇；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：20µL；

波長(zhǎng)變化見表1：

表1 波長(zhǎng)變化梯度表

組分

時(shí)間/min

波長(zhǎng)/nm

維生素A

0

325

維生素D3

5

264

維生素E

9

294

4. 結(jié)果與討論

 

圖1 低濃度維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

從左至右依次為：維生素A（5.0µg/mL）、維生素D3（9.8µg/mL）、維生素E（99µg/mL）

4.1 工作曲線及檢出限

根據(jù)儀器對(duì)各個(gè)物質(zhì)的響應(yīng)情況，將維生素A、D3、E分別由儲(chǔ)備液用正己烷逐級(jí)稀釋，各稀釋成7個(gè)濃度，維生素A濃度范圍為0.25µg/mL~25µg/mL，維生素D3濃度范圍為0.30µg/mL~30µg/mL，維生素E濃度范圍為2.5µg/mL~250µg/mL，將溶液進(jìn)HPLC進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出檢出限，回歸方程及檢出限見表2?？梢?，液相色譜儀對(duì)維生素A、D3、E的響應(yīng)與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表2 線性回歸方程及檢出限

化合物

回歸方程

相關(guān)系數(shù)

檢出限

LOD*

（µg/mL）

維生素A

y=55.572*x-1.517

1

0.02

維生素D3

y=57.608*x-1.9814

1

0.05

維生素E

y=8.1342*x-1.9094

1

0.39

 

圖2 皂化-固相萃取法色譜圖

4.2 皂化-固相萃取和傳統(tǒng)皂化-液液萃取法的實(shí)驗(yàn)效果對(duì)比

傳統(tǒng)皂化-液液萃取法參考《GB 5413.9—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E 的測(cè)定》的樣品前處理2個(gè)奶粉（每個(gè)樣稱取2g）的平行樣，作為參照。同時(shí)以皂化固相萃取法做兩個(gè)平行樣品。

 

表3 傳統(tǒng)皂化-液液萃取法與皂化固相萃取法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

維生素A峰面積

維生素D峰面積

維生素E峰面積

傳統(tǒng)皂化-液液萃取法

778

0

148

皂化固相萃取法

1500

0

716

由于選用的奶粉VD含量較低，沒有檢出。

從上述對(duì)比可以看出，皂化固相萃取法相比國(guó)標(biāo)的皂化液液萃取法具有簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)萃取效果更好。*的缺點(diǎn)是出峰靠前的維生素A附近有較多的弱保留物質(zhì)的干擾，但是依靠MP C18的強(qiáng)大的分離能力，可以實(shí)現(xiàn)分離維生素A和干擾物質(zhì)的基線分離。同時(shí)這些弱保留的物質(zhì)很容易被洗脫出色譜柱，所以不會(huì)對(duì)色譜柱造成較大的污染。

4.2.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表4 加標(biāo)回收率及精密度

 

化合物

樣1（%）

樣2（%）

樣3（%）

樣4（%）

樣5（%）

平均回收率%

RSD（%，n=5）

低濃度

加標(biāo)

維生素A

89.91

91.48

86.12

89.59

90.12

89.44

2.33

維生D3

112.36

114.63

106.34

111.63

105.35

110.06

3.83

維生素E

85.58

86.87

81.83

85.64

84.56

84.90

2.86

高濃度

加標(biāo)

維生素A

88.84

91.48

89.61

86.43

89.57

89.18

2.04

維生D3

93.06

94.65

93.19

90.38

92.86

92.83

1.66

維生素E

86.68

87.62

87.00

83.25

85.94

86.10

1.98

 

4.2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

根據(jù)所建立的方法分析了從市場(chǎng)上購買的3種品牌奶粉，分別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)按照上述方法進(jìn)行樣品處理和檢測(cè)，所得維生素A、D3和E的含量結(jié)果見表6。

圖7. 2號(hào)奶粉樣品色譜圖

表6 奶粉中維生素含量（µg/g）

化合物

1號(hào)

（µg/g）

2號(hào)

（µg/g）

3號(hào)

（µg/g）

維生素A

6.008

42.5

165.0

維生素D3

0.392

0.000

0.463

維生素E

5.712

6.231

9.344

4.3 結(jié)論

采用改進(jìn)后的皂化-固相萃取方法來替代傳統(tǒng)的皂化法來測(cè)定奶粉中維生素含量，皂化能充分提取出奶粉中維生素A，D，E，再經(jīng)過Cleanert Vitamin固相萃取柱進(jìn)行凈化吸附洗脫，既避免了傳統(tǒng)皂化中液液萃取中有機(jī)溶劑的大量使用，也簡(jiǎn)化了操作步驟，同時(shí)能滿足一般奶粉樣品的含量分析要求。

5.訂貨信息

產(chǎn)品名稱

規(guī)格包裝

訂貨號(hào)

LC-10F液相色譜儀

10ml/min，梯度系統(tǒng)，200-800nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)器

FL-LC010GS

LC-10F液相色譜儀

配紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器

LC-10F

CC-100分析型色譜柱溫箱

溫控范圍：5-70℃；

可安裝1-2支300mm色譜柱

CC-100

Qdaura 卓睿™全自動(dòng)固相萃取儀

4通道24位

SPE-40

Cleanert Vitamin脂溶性維生素萃取柱

1g/12mL , 20支/pk

V00012(報(bào)價(jià)：1360元/盒）

Venusil MP C18液相色譜柱

4.6 mm x150 mm，5µm

V952505-0

微孔過濾膜（PTFE疏水）-雙膜

045µm,直徑13mm,100/pk

AS041345-P

微孔過濾膜（PVDF親水）-雙膜

0.45µm,直徑13mm,100/pk

AS073345-G

一次性無菌注射器

5mL, 100/pk

ZSQ-5ML

1.5mL樣品瓶

100/pk

1109-0519

1.5mL樣品瓶蓋

100/pk

0915-1819

甲醇

4×4L/瓶

AH230-4

乙醇

4×4L/箱

AH090-4

乙酸乙酯

4×4L/箱

AH100-4

正己烷

4×4L/箱

AH216-4